因為早期昆劇屬于南戲系統，所以它繼承了南戲的角色行當體制，同時兼收北雜劇之長，以生、旦、淨、末、丑、外、貼七行為基礎角色，早期作品《浣紗記》反映了昆劇初創時期的角色分行法，即除遵循南戲的七行之外，還借鑒了元雜劇的小末、小旦等設置法，更增設小生、小旦、小末、小外、小淨五行，共十二行。
明末昆劇興盛期，明刊本《墨憨齋定本傳奇》中，將原以「貼」扮老年婦女改為「老旦」，亦系吸收了元雜劇之分行法。其他角色行當基本同于昆劇初創時期。清康熙時，昆劇角色行當還基本保持了「江湖十二角色」的體制。
乾隆年間，昆劇折子戲最盛，表演藝術有了進一步提高，為刻畫人物而設的角色行當體制，也有了新的突破。《揚州畫舫錄》中有「江湖十二角色」之說，它們是︰副末、老生、正生、老外、大面、二面、三面，謂之「男角色」；老旦、正旦、小旦、貼旦，謂之「女角色」；又有打諢一人，叫做「雜」。後來在南方昆劇中演變為以小生和旦角為主要角色，因之這兩門分得更為細致。小生行下分︰大官生、小官生、巾生、鞋皮生（窮生）和雉尾生五類。旦行則下分︰老旦、正旦、作旦（能扮演男孩子）、四旦（刺殺旦）五旦（閨門旦）和六旦（貼旦）六類。但各個昆劇支派有各自的門類。
昆劇的角色分工隨著表演藝術的發展，也越來越細致。嘉、道間，昆劇角色行當，將原有的「江湖十二角色」，與後來出現更細的分工相結合，在「生、旦、淨、末、丑」五大行當之下，又細分二十小行，稱作「二十個家門」。
在「生」這個家門中，又分為官生、巾生、鞋皮生、雉尾生，用以表演不同的角色人物。官生一行，扮演做了官的成年男子，其中由于年齡大小、身份高低不同又分大、小官生。例如《長生殿》的唐明皇、《太白醉寫》中的李白都由大官生扮演；《荊釵記》中的王十朋、《金雀記》中的潘岳都由小官生扮演。官生與巾生的表演有所不同︰巾生飾演風liu儒雅的年輕書生，清灑飄逸，歌唱要求真假嗓結合，假嗓成份較大，清脆悅耳；官生在表演上要灑月兌大方，大官生更要富于氣派，在唱法上也是真假嗓結合，但真嗓落在比巾生用真嗓時更高的音域，以洪亮為美。
旦行也細分為老旦、正旦、作旦、四旦、五旦、六旦。但實踐中還有一個貼旦，共為七個家門。
正旦一般扮演身份比較貧寒的已婚女子，如《琵琶記》中的趙五娘，《金鎖記》中的竇娥，《貨郎擔》中的張三姑等。正旦在表演上側重樸實大方，在唱法上，咬字噴口都要有較大的力度，音色明亮、寬厚，音量也要求較大。正旦劇目頗豐富，所扮演各類人物性格均具鮮明特點，為演員提供了寬廣的表演空間。
此外，淨行分大面與白面，大面臉譜以紅、黑二色為主，故有「七紅、八黑、三和尚」之說；白面大多扮演反面人物，除眼紋外，全臉皆涂以白粉，通常又分成相貂白面、褶子白面、短衫白面等，白面有時也扮正面人物，或無所謂好壞的角色，有時也扮女角等。還有由白面行中析出的邋遢白面，除面涂白粉以外，在眼角、鼻窩等處，加上一些黑紋，故名。所扮者大多是下三流角色，又近于插科打諢式的人物。
末行又細分為老生、末、老外。昆劇老生不分文武，如《寶劍記》的林沖，《麒麟閣》的秦瓊等。末腳所戴胡須也是從黑三到白滿，與老生同。
丑行又分為副（又稱「二面」）和丑兩個家門。其區別是副的面部白塊畫過兩邊眼梢，而丑只畫到眼的中部，副常穿褶子、宮衣、袍，而丑多穿短衣。
昆劇以前的南戲和元雜劇都沒有這樣的行當，由于「副」行的出現，昆劇把丑行的表演範圍，擴大到上層社會的衣冠縉紳之中。所扮演者大多是不正派的文人、奸臣、刁吏、惡訟師、幫閑篾片之類人物，這些角色的共同特點是奸刁刻毒，表里不一，表演上多強調其冷的一面，稱之為「冷水二面」。
丑行因其面部白塊較副為小，也稱「小花臉」，因其排列于二面之後，也稱「三花臉」，所扮大多是社會地位較低或滑稽可愛的角色，如《尋親記》的茶博士，《漁家樂》的萬家春。昆劇丑腳不分文武，有時扮演武功繁重的身段戲。
丑行和二面一樣，也可扮演婦女，如《風箏誤》年輕的千金詹愛娟，《荊釵記》中的張姑母。丑腳也扮演反面人物，如《十五貫》的婁阿鼠。
另有一個應各種群眾角色的「雜」行，是指各種劇中沒有名姓的群眾角色，如車夫、船夫、傘夫、衙役、太監、宮女、龍套等，通常不計為家門。
傳統昆劇職業班社，一般只需十八個演員，俗稱「十八頂網巾」，只有極少數大班社有二十七名演員。一般班社只要十個家門齊全，就可演出，其他角色可以由家門接近的演員來替代，這十個基本家門被稱為「十大庭柱」，他們是︰淨、官生、巾生、老生、末、正旦、五旦、六旦、副、丑。其中最能決定演出質量的是︰淨、老生、官生、正旦四個家門。
昆劇的各個行當都在表演上形成自己的一套程式和技巧，這些程式化的動作語言在刻畫人物性格、表達人物心理狀態、渲染戲劇性和增強感染力方面，形成了昆曲完整而獨特的表演體系。